Chemische Evaluierung des allergenen Potentials tierischer Proteine in Weinen durch immunologische, elektrophoretische und chromatografische Verfahren ; Chemical evaluation of the allergenic potential of animal proteins in wines by immunologic, electrophoretic, and chromatographic methods

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Abstract

Tierische Proteine werden seit hunderten von Jahren in der Produktion von Weinen eingesetzt. In einem Prozess, der als Schönung bezeichnet wird, dienen sie der Verhinderung von Trübungen, sowie der Ausformung und Verfeinerung des Weincharakters durch Adsorption unerwünschter Stoffe. Hierfür werden Schwimmblasen verschiedener Fische, Kuhmilch- oder Hühnereiproteine eingesetzt. In neuerer Zeit haben jedoch auch Fischgelatinen, sowie das zur Kontrolle der Mikroflora geeignete Enzym Lysozym, welches aus Hühnerei-Eiklar gewonnen wird, in der Weinherstellung an Bedeutung gewonnen. Obwohl für die Verwendung tierischer Proteine in der Weinproduktion keinerlei negative Auswirkungen auf die Gesundheit des Verbrauchers bekannt sind, sind diese in den letzten Jahren durch den Erlass verschiedener rechtlicher Regelungen in der Europäischen Union (EU), Australien, Neuseeland, Japan und den USA in den Fokus des Interesses gerückt. Diese Regelungen verfolgen den Zweck der Kennzeichnung allergener Stoffe auf Lebensmitteln, wozu auch die in der Schönung eingesetzten tierischen Proteine gehören. Allerdings gilt ein allergenes Potential durch Schönungsmittel tierischer Herkunft im Wein aus wissenschaftlicher und technologischer Sicht als zweifelhaft, da Schönungsmittel mit den zu entfernenden Substanzen zu unlöslichen Verbindungen reagieren, welche im Laufe der Weinproduktion präzipitieren und aus dem Wein durch geeignete Maßnahmen entfernt werden. Zudem wirken weitere Behandlungsmethoden wie die Schönung mit Bentoniten, die der Vermeidung proteinogener Trübungen in Weinen dient, dem Proteingehalt in Weinen entgegen. Ziel dieser Dissertation war es, Methoden zur Bestimmung von Schönungsmitteln auf der Basis von Fisch-, Milch- und Eiproteinen, sowie dem Hühnerei-Allergen Lysozym, in Weinen zu entwickeln und deren allergenes Potential zu evaluieren. Hierzu hat sich in der Proteinanalytik der ELISA fest etabliert. Als Hilfsmittel wurde die SDS-PAGE in Verbindung mit verschiedenen Färbemethoden und Western-Blotting angewendet. Hierdurch war es möglich, die Schönungsmittel hinsichtlich ihrer Proteinkomposition und ihrer Antigenität genauer zu charakterisieren. Für die Bestimmung des Lysozyms wurde neben dem ELISA die HPLC in Verbindung mit einer empfindlichen Fluoreszenzdetektion angewendet. Im Rahmen dieser Dissertation gelang es, empfindliche, präzise und richtige Nachweismethoden zu entwickeln, mit welchen alle untersuchten Schönungsmittel und das Lysozym mit Nachweisgrenzen zwischen 0,01 – 1,1 ppm in Weinen detektiert werden konnten. Mit Hilfe dieser Methoden wurden verschiedene Modell- und Handelsweine untersucht, welche Rückstände an tierischen Schönungsmitteln in Mengen von bis zu 0,4 ppm aufwiesen. Diese Rückstände unterlagen allerdings einem deutlichen Einfluss durch die weitere Prozessierung des Weines. So konnte für alle untersuchten Schönungsmittel eine starke Abhängigkeit der Rückstände von der Behandlung mit Bentonit und dessen anschließendem Abzug durch Filtration festgestellt werden. Es ist somit möglich, Rückstände allergener Schönungsmittel durch geeignete technologische Verfahren signifikant zu reduzieren. Unabhängig von der Prozessierung oder der Dosierung der Schönungsmittel konnte jedoch kein allergenes Potential für die in Weinen nachgewiesenen Schönungsmittelrückstände gezeigt werden. Basierend auf diesen Ergebnissen, denen anderer Arbeitsgruppen und der Tatsache, dass allergische Reaktionen auf Rückstände von Schönungsmitteln in Weinen bislang nicht beobachtet wurden, erscheint ein allergenes Potential in Weinen durch die Schönung mit tierischen Proteinen somit unwahrscheinlich. Eine Kennzeichnung von Schönungsmitteln auf Weinen wird durch diese Studien somit nicht unterstützt, auch wenn das allergene Potential nicht zweifelsfrei ausgeschlossen werden konnte. Die Befunde für die Schönungsmittel lassen sich teilweise auf das Lysozym übertragen. So stellt auch hier die Behandlung mit Bentonit und dessen anschließende Abtrennung durch Filtration einen potenten Prozessierungs-Schritt zur Reduzierung der Lysozym-Rückstände dar. Anders als bei den Schönungsmitteln wurden jedoch in Lysozym-behandelten Weinen, welche anschließend nicht mit Bentonit prozessiert wurden, Rückstände von bis zu 327 ppm nachgewiesen. Für diese Rückstände konnte in vitro und in vivo ein deutliches allergenes Potential diagnostiziert werden. Bentonit-prozessierte Weine hingegen wiesen nur Gehalte von maximal 0,06 ppm Lysozym auf, für welche kein allergenes Potential festgestellt werden konnte. Somit konnte für die Behandlung mit Lysozym, nicht jedoch für die eigentliche Schönung unter bestimmten Umständen ein klares allergenes Potential gezeigt werden. Eine Kennzeichnung von Lysozym ohne weitergehende Untersuchungen und Standarisierung technologischer Verfahren zur Reduktion der Lysozymrückstände ist im Sinne des Verbraucherschutzes somit vorerst unumgänglich. ; Proteins derived from animals are used in the production of wines since many centuries. They serve for the removal of haze and for the development and improvement of the wine's character due to the adsorption of undesired substances. This process is known as fining. Traditionally, proteins derived from bovine milk and hen's egg as well as swim bladders from various fishes are used as fining agents. However, further materials such as fish gelatine have recently been introduced and the hen's egg derived enzyme lysozyme has been allowed for the microbial control of the wine production since some years. Until now, no impairment of the consumer's health has been reported as a result of the fining with animal proteins. Nevertheless, these fining agents are currently in the spotlight of interest due to the introduction of new labeling rules within the European Union, Australia, New Zealand, Japan, and the USA. According to these labeling rules, fining agents must be indicated on the respective food package because they are derived from allergic foods, such as fish, milk, and hen's egg. No evidence exists that fining agents actually remain in the wine because they react with wine components to insoluble compounds that are removed from the wine during the fining process. Furthermore, additional processing steps such as the treatment with bentonite, a strong adsorbent for proteins that is used for the prevention of proteinogenic haze, may contribute to the removal of fining agents from the wine. Thus, the application of the labeling rules to wines is doubtfully discussed from the scientific and technological point of view. An unjustified wine labeling could lead to uncertainty, irritation, and deterrence of the consumer and would lead to an avoidable limitation of the habits and the quality of life of consumers allergic to foods. The objective of this dissertation was the development of methods for the determination of fining agents derived from allergenic foods and lysozyme in wines and the evaluation of their allergenic potential. Therefore, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a wellknown and commonly used method that was applied in these studies. Sodiumdodecylsulfate-Polyacrylamide gel-electrophoresis (SDS-PAGE) in combination with different staining methods and Western-Blotting was additionally applied to characterize the composition and antigenicity of the various fining agents. Furthermore, high performance liquid chromatography (HPLC) in combination with a sensitive fluorescence detection was used for the determination of lysozyme in wines beside the ELISA. Sensitive, precise, and accurate methods were developed and were capable to detect traces of all investigated fining agents in wines. Limits of decision were found to be between 0.01 – 1.1 ppm. The investigation of various experimental and commercial wines revealed residues of animal fining agents of up to 0.4 ppm. Thereof, wines that were fined with excessive but commercially applied dosages of fining agents showed the highest residues. All these residues were found to be in strong relation to the further wine processing. Processing with bentonite and the subsequent bentonite removal by filtration led to a significant decrease of fining agent residues in the finished wines. Thus, it is possible to reduce the amounts of allergenic fining agents by technological processing. However, an allergic potential of the detected fining agent residues was not recognized regardless of which fining agent dosage or wine processing was applied. Consequently, an allergic potential of wines due to the fining process appears unlikely based on these and other studies, as well as due to the fact that adverse reactions caused by fining agent residues in wines have not been reported. Thus, the labeling of fining agents on wines is not supported by these studies even though the allergic potential could not be fully excluded. Most of the results that were achieved for the fining agents were transferable to lysozyme. The processing with bentonite and the subsequent bentonite removal by filtration appear to be proper methods for the significant decrease of residual lysozyme in wines. Anyhow, wines that were treated with lysozyme but not with bentonite revealed residues of lysozyme of up to 327 ppm. These residues showed a clear allergic potential in vitro and in vivo. Contrarily, wines that were treated with lysozyme and bentonite showed amounts of maximal 0.06 ppm lysozyme with no detectable allergic potential in in vitro and in vivo tests. Consequently, lysozyme was the only investigated material that was proven to present a clear allergic potential for persons allergic to foods. Labeling of lysozyme without further research and standarization of technological processes, in order to reduce the residues of lysozyme in wines and to assure the consumer's safety, is inevitable for the present.